2023年11月12日中國農業(yè)科學(xué)院植物保護研究所劉欣剛研究團隊在Science of the Total Environment雜志發(fā)表了“Imidacloprid affects the visual behavior of Mature zebrafish by mediating the expression of opsin and phototransduction genes and altering the metabolism of neurotransmitters”，揭示了吡蟲(chóng)啉通過(guò)介導視蛋白和光轉導基因的表達，改變神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，從而影響成年斑馬魚(yú)的視覺(jué)行為。
吡蟲(chóng)啉是硝基亞甲基類(lèi)內吸殺蟲(chóng)劑，是煙堿乙酰膽堿受體的作用體，干擾害蟲(chóng)運動(dòng)神經(jīng)系統使化學(xué)信號傳遞失靈，吡蟲(chóng)啉對水生生態(tài)系統構成重大威脅。本研究探討了吡蟲(chóng)啉對成年斑馬魚(yú)的視覺(jué)毒性及其分子機制。視動(dòng)反應是指斑馬魚(yú)對移動(dòng)的目標有一種追逐的行為，該反應可以用來(lái)檢測幼魚(yú)和成魚(yú)的視覺(jué)相關(guān)基因突變。視動(dòng)反應(OKR)和視運動(dòng)反應(OMR)測試是經(jīng)典的用于檢測斑馬魚(yú)視覺(jué)功能異常的行為測試（OKR/OMR設備和分析軟件購自上海欣軟）。利用該設備在環(huán)境相關(guān)濃度暴露吡蟲(chóng)啉21天后，檢測發(fā)現成年斑馬魚(yú)的視覺(jué)行為受損，Immunofluorescence Experiment表明，斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜中視紫紅質(zhì)的含量發(fā)生了明顯的變化。在成年斑馬魚(yú)中，基因表達節律在暗和亮光捕獲中起關(guān)鍵作用，以及光轉導的24小時(shí)被顯著(zhù)破壞。靶向代謝組學(xué)分析顯示，與神經(jīng)遞質(zhì)功能相關(guān)的16種代謝物的含量發(fā)生了顯著(zhù)變化，并在精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、色氨酸代謝等前三種代謝途徑中富集。這些結果表明，環(huán)境相關(guān)濃度的吡蟲(chóng)啉暴露可通過(guò)干擾視蛋白的表達，影響斑馬魚(yú)成蟲(chóng)視網(wǎng)膜中的光轉導而引起光毒性。
測試裝置為透明圓柱形魚(yú)缸，直徑為7 厘米，高7厘米，直徑8.5厘米的滾輪放置在魚(yú)缸周?chē)泄鈻艞l（12個(gè)周期的黑白條紋）。外部光系統由兩個(gè)圓形光管組成，直徑為21厘米，調節亮度。實(shí)驗視頻是在帶攝像頭的顯微鏡（OLYMPUS SZX10，日本），可捕獲并記錄實(shí)時(shí)運動(dòng)。所有OKR和OMR測試均已通常在10:00至16:00之間進(jìn)行。OKR/OMR設備和分析軟件對從眼球追蹤設備收集的數據進(jìn)行分析以確定順時(shí)針和逆時(shí)針?lè )较虻木W(wǎng)格刺激對眼球運動(dòng)的影響。OMR測試中可檢測運動(dòng)距離（m）、運動(dòng)速度（m/s）、PPR時(shí)間（s）、PNR時(shí)間（s）和僵直時(shí)間（s）等。
與對照組相比，暴露于吡蟲(chóng)啉濃度10 μg/L 21天，成年斑馬魚(yú)右眼受到順時(shí)針刺激時(shí)，慢相時(shí)間和反射增益均顯著(zhù)減少，掃視運動(dòng)頻率增加當改為逆時(shí)針刺激時(shí)，暴露于10 μg/L吡蟲(chóng)啉的成年斑馬魚(yú)右眼和左眼的慢相位時(shí)間以及反射增益均顯著(zhù)減少。與對照組相比，用10 μg/L濃度的吡蟲(chóng)啉處理后各組左右眼的眼跳運動(dòng)頻率明顯增強。然而，濃度為1和100 μg/L的吡蟲(chóng)啉的斑馬魚(yú)的參數沒(méi)有顯著(zhù)變化。這些結果表明，濃度為10 μg/L的吡蟲(chóng)啉暴露影響了斑馬魚(yú)對視覺(jué)刺激的平穩跟蹤和準確、有效的快速眼球運動(dòng)的能力，這可能會(huì )影響斑馬魚(yú)的運動(dòng)協(xié)調。
成年斑馬魚(yú)在接受順時(shí)針和逆時(shí)針網(wǎng)格刺激時(shí)，行走距離和速度顯著(zhù)下降，10 μg/L和100 μg/L處理組斑馬魚(yú)的凍結時(shí)間顯著(zhù)增加。此外，與對照組相比，10 μg/L吡蟲(chóng)啉處理的成年斑馬魚(yú)在刺激方向的游泳時(shí)間顯著(zhù)減少。這些結果表明，吡蟲(chóng)啉暴露對成年斑馬魚(yú)的視覺(jué)系統處理和視覺(jué)引導下的自我運動(dòng)的能力有負面影響，證實(shí)了OKR試驗的結果。
作者接下來(lái)進(jìn)行組織病理學(xué)分析，以確定視網(wǎng)膜切片是否發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變，視網(wǎng)膜層是否受到特異性影響。對照組和用藥組形態(tài)完整，形狀規則，由神經(jīng)節細胞、內叢狀、內核、外叢狀、外核層、光感受器和色素細胞組成。Immunofluorescence Experiment使用特異性抗體標記視網(wǎng)膜中相應的標記物。結果顯示，Sox2（Sry-box 2，視網(wǎng)膜祖細胞標記物）和Islet1（ISL1基因，神經(jīng)節細胞和神經(jīng)節細胞標記物）的陽(yáng)性細胞密度或陽(yáng)性細胞百分比均無(wú)顯著(zhù)差異。然而，與對照組相比，成年斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜在10 μg/L后的陽(yáng)性細胞密度和陽(yáng)性細胞的百分比顯著(zhù)降低。用藥組中視網(wǎng)膜色素上皮中的一種蛋白質(zhì)Rpe65（類(lèi)視黃醇異構水解酶65）的百分比顯著(zhù)高于對照組。
10 μg/L的吡蟲(chóng)啉暴露顯著(zhù)改變了4個(gè)視蛋白基因的表達節律，即opn1mw3、opn1lw2、opn1sw2和rho、一個(gè)轉導基因gnb3b和一個(gè)抑制蛋白基因arr3a與視網(wǎng)膜中的光轉導有關(guān)。此外，與視黃醇代謝相關(guān)的基因rpe65a的相對表達量也發(fā)生了顯著(zhù)變化。然而，相對表達水平在24h期間的非視覺(jué)視蛋白基因opn3和opn4b，和sox2，胰島1和hcrt沒(méi)有顯著(zhù)改變。
通過(guò)靶向代謝組學(xué)分析，研究了成年斑馬魚(yú)中吡蟲(chóng)啉暴露后參與神經(jīng)遞質(zhì)功能的39種代謝物的改變。如圖顯示了吡蟲(chóng)啉處理組與對照組的39種代謝物含量的熱圖。吡蟲(chóng)啉暴露后，斑馬魚(yú)大腦中16種代謝物水平發(fā)生顯著(zhù)變化，其中11種代謝物升高。KEGG通路分析顯示，有10條通路顯著(zhù)富集，其中9條通路參與代謝，1條與遺傳信息處理相關(guān)。前三的代謝途徑是精氨酸生物合成；丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝和色氨酸代謝。網(wǎng)絡(luò )分析可以直觀(guān)地探索為一個(gè)交互式網(wǎng)絡(luò )，其節點(diǎn)（代謝物）大小對應于節點(diǎn)度和基于兩個(gè)連接節點(diǎn)之間的相關(guān)性的邊緣厚度。六種富含丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的代謝物和五種富含色氨酸代謝的代謝物主要通過(guò)L-谷氨酸相互作用和影響。
一些研究報告稱(chēng)，吡蟲(chóng)啉暴露在高劑量或亞致死劑量下誘發(fā)昆蟲(chóng)視覺(jué)功能障礙。在本研究中，將成年斑馬魚(yú)暴露于環(huán)境相關(guān)濃度的吡蟲(chóng)啉中21天，結果表明，吡蟲(chóng)啉暴露通過(guò)破壞視蛋白和光傳導級聯(lián)相關(guān)基因的表達節律，導致斑馬魚(yú)的視覺(jué)行為異常，導致色氨酸代謝失衡谷氨酸系統與光敏功能和視覺(jué)處理有關(guān)。作者的研究證實(shí)了新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑所造成的視覺(jué)毒性風(fēng)險。此外，研究結果可能為晝夜節律和視網(wǎng)膜功能之間的相互作用提供證據。
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